猪圆环病毒2型Rep蛋白的ATP酶和解旋酶活性的研究

【摘要】猪圆环病毒(PorcineCircovirus,PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属成员,是迄今发现最小的哺乳动物病毒之一。其基因组为单链环状DNA,大小约为1.76kb,含有两个主要的编码框。主要分为两种型：猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2).PCV1被认为没有致病性,而PCV2被证实是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的病原,同时也可引起猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤、增生性坏死性肠炎。猪圆环病毒已在全球各地流行,给养猪业造成严重危害。目前,对于猪圆环病毒引起的相关疾病还没有有效治疗方法,只能采取疫苗接种进行预防,且效果不够理想。只有通过对该病毒的复制机理及蛋白功能进行更加深入的研究,才能找到更好的防治手段。Rep蛋白是一种多功能蛋白,在PCV2病毒复制的多个过程中都起着至关重要的作用。通过同源比对发现Rep蛋白的C端存在解旋酶功能域,而目前为止,对于Rep蛋白的解旋活性的研究还没有开展。本研究对PCV2的Rep蛋白解旋相关功能开展研究,为猪圆环病毒2型蛋白功能、复制及致病机理的研究提供参考。具体工作如下：1.Rep蛋白表达质粒的构建及蛋白的表达纯化扩增rep基因,将其连接到pET-28aSUMO、pET-30a等5种原核表达载体上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中对不同载体的表达纯化条件进行了摸索,最终选择pET-28aSUMO为表达载体,通过镍亲和层析纯化,得到了SUMO-Rep融合蛋白,并用SDS-PAGE及Westernblot进行了鉴定。2.SUMO-Rep蛋白的ATPase活性检测利用Kinase-GloPlusLuminescentKinaseAssayKit对体系中剩余ATP的量进行检测,来测定ATPase活性。得到了酶促动力学相关参数,确定了Mg2+为ATPase反应最佳二价金属离子,证明了寡聚核苷酸的加入对ATPase活性无促进作用。3.SUMO-Rep蛋白的核酸结合活性检测用EMSA的方法证明了SUMO-Rep具有非特异性的ssDNA和带有3’突出端的dsDNA结合活性,且其结合不需要二价金属离子和ATP的参与。4.SUMO-Rep蛋白的解旋活性检测应用荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的原理,建立了SUMO-Rep解旋酶活性的检测方法,并对其解旋活性进行测定。得到酶促动力学相关参数,探究了二价金属离子、NTP、捕获链、温度对解旋反应的影响。确定了最佳反应金属离子及浓度为Mn2+15mM,最佳ATP浓度为2mM,最适温度为37℃,并在最适反应条件下测得SUMO-Rep的Km值为104.32nmol/L5.SUMO-Rep蛋白K180A突变体的构建与其ATPase口解旋活性检测构建了SUMO-RepK180A蛋白突变体。活性检测发现其ATPase成功失活,且其解旋活性显著降低,说明K180A是Rep蛋白ATPase活性的关键位点。
【作者】周旋；
【导师】陈焕春；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】猪圆环病毒(PCV)；Rep；ATPase活性；解旋活性；核酸结合活性；

【参考文献】
[1]王磊.激光熔覆带宽度实时检测与控制研究[D].湖南大学,车辆工程,2012,硕士.
[2]任金鼎.射线能量对应用RapidArc进行肝肿瘤放疗的剂量学影响[D].清华大学,生物医学工程（专业学位）,2012,硕士.
[3]夏世德.利用电子废弃物中多组分共混高分子材料制备改性沥青的技术工艺与设备研究[D].昆明理工大学,冶金物理化学,2014,博士.
[4]孙希芝.超声引导下骶管麻醉在小儿手术中的应用[D].青岛大学,麻醉学,2013,硕士.
[5]王美娜.我国区域金融中心布局的发展现状及对策[D].吉林大学,金融,2014,硕士.
[6]杨丹.母乳中PBDEs的暴露和PBDEs的生物利用度及健康风险评估[D].上海大学,环境工程,2014,硕士.
[7]付璐.初三年级化学课案设计中问题引领的研究与实践[D].辽宁师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[8]包星月.A汽车零部件仓储中心配送服务满意度评价研究[D].吉林大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[9]郑春一.Web Services在地理信息共享中的应用研究[D].华北电力大学（河北）,计算机应用技术,2004,硕士.
[10]顾彬.苏南农村独生子女父母养老问题研究[D].南京师范大学,社会学,2012,硕士.
[11]王蓉.基于对甲基苯磺酰亚甲基异腈构建吡咯衍生物的研究[D].苏州大学,有机化学,2014,硕士.
[12]蓝善民.高铁站应急疏散研究[D].西南交通大学,交通运输工程,2014,硕士.
[13]屈隆.锰铈改性复合金属氧化物催化剂脱除烟气中NO的研究[D].湖南大学,环境工程,2014,硕士.
[14]束志恒,陈德钊,陈亚秋.粗糙集方法及其在化学模式分类规则挖掘中的应用[J].分析化学,2004,07:879-883.
[15]孙雅谊.DAHP下调NOS通路和TP上调PI3K/Akt通路的抗炎抗凋亡作用对脑缺血的神经保护机制研究[D].浙江大学,人体解剖与组织胚胎学,2014,硕士.
[16]李雪燕.玉米鼠耳病病原鉴定及检测系统建立[D].西南农业大学,农业昆虫与害虫防治,2004,硕士.
[17]韩敏,李政.基于云-神经网络的多属性模糊规则分类[J].控制与决策,2009,06:933-936.
[18]吴永祥.《德意志意识形态》正义思想研究[D].浙江理工大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[19]洪远.关于盗窃罪量刑规范化存在问题及对策的调研报告[D].广西师范大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[20]徐虹.艾司洛尔在螺旋CT冠脉造影中的临床应用[D].山东大学,老年医学（专业学位）,2013,硕士.
[21]梁国利.南京国民政府时期江苏省救济院研究[D].苏州大学,中国近现代史,2013,硕士.
[22]王新洲,柳宗伟,陈顺清.城市人口地理信息系统建设模式探讨[J].武汉大学学报(信息科学版),2001,03:226-231.
[23]刘邦凡.论我国高校海洋教育发展及其研究[J].教学研究,2013,03:9-14+123.
[24]周婉.基于语料库的有关南海法律文本的批评性语篇分析[D].武汉理工大学,英语语言文学,2012,硕士.
[25]杨俊波.当代汉语儿歌节律研究[D].安徽大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[26]董利戈.SDLT公司第三代移动通信业务竞争战略[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[27]昊日乐.功能翻译理论视角下交替传译中信息缺失现象及应对政策[D].内蒙古大学,翻译,2014,硕士.
[28]唐晓宁,田明伟,曲丽君.石墨烯纤维,距离石墨烯纺织品还有多远?[J].新材料产业,2014,11:15-19.
[29]黄天柱.三维织态自组装聚吡咯膜的合成与表征[D].西安科技大学,材料物理与化学,2014,硕士.
[30]王浩.论入世对我国证券市场行政监管模式的影响及改革思路[D].东北师范大学,政治学理论,2003,硕士.
[31]阮陈孝辉（NguyenTranHieuHuy）.硝基还原酶的资源挖掘及其在芳香羟胺可控合成中的应用研究[D].华东理工大学,生物化工,2014,硕士.
[32]南德玛.《元朝秘史》专有名词总译研究[D].内蒙古师范大学,中国古典文献学,2012,硕士.
[33]高鑫欣.钝化片状锌粉/环氧树脂复合材料的制备及介电性能研究[D].内蒙古科技大学,材料加工工程,2014,硕士.
[34]张礼才.网络突发事件政府信息发布研究[D].华中科技大学,公共安全预警与应急管理,2013,硕士.
[35]郭伟.多轴柔性冷弯成型控制系统设计[D].北方工业大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[36]胡甬.从集体无意识视角解读《牛栏事件》[D].杭州电子科技大学,英语语言文学,2012,硕士.
[37]尉志奇.皇甫煤业集团并购方案设计[D].西安科技大学,工商管理,2014,硕士.
[38]岳小静.血清IGF-1与2型糖尿病肾病的相关性分析[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[39]杜敏.中小学网络教育资源生存透析[D].南京师范大学,2003.
[40]李琳.金花茶水提取物对人胃癌MGC-803细胞增殖和周期的影响[D].广西医科大学,肿瘤学,2013,硕士.
[41]唐绪武.多项目多资源关键链项目进度计划方法[D].国防科学技术大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[42]王健.地震灾害管理研究[D].北京交通大学,2008.
[43]张秋政.超宽带雷达信号脉冲压缩的研究[D].江苏科技大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[44]陈勇.锡原子材料让计算机“跑”的更快[J].内江科技,2014,01:148.
[45]宋汉武.喷水调节阀[J].发电设备.1992(05)
[46]张星.“卓越工程师”人才可雇佣性研究[D].上海理工大学,企业管理,2012,硕士.
[47]王冬.保定市中学教师业余体育锻炼现状调查研究[D].河北师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[48]李懿然.《二泉映月》多种演绎版本的演奏特征分析[D].天津音乐学院,音乐表演,2014,硕士.
[49]董侃,刁利军,赵雷廷,刘志刚.基于基本矢量钳位策略的过调制算法研究[J].铁道学报,2014,06:35-40.
[50]刘超.四轮独立线控电动车执行器容错控制算法研究[D].吉林大学,车辆工程,2014,硕士.